小鼠膽管類器官是一種在體外三維培養(yǎng)體系中，由膽管上皮細(xì)胞或干細(xì)胞衍生、自我組織形成的微型結(jié)構(gòu)。該模型能模擬膽管的上皮屏障功能、分泌特性及對損傷的應(yīng)答，其成功構(gòu)建與長期培養(yǎng)高度依賴于一套精確的細(xì)胞因子組合。

第一部分：關(guān)鍵生長因子的核心作用

膽管類器官的體外構(gòu)建依賴于幾種關(guān)鍵生長因子的協(xié)同作用，這些因子為細(xì)胞的增殖與形態(tài)發(fā)生提供了基礎(chǔ)信號支持。

表皮生長因子（EGF）

表皮生長因子是一種高效的有絲分裂原，在膽管類器官培養(yǎng)中提供基礎(chǔ)的增殖信號。EGF通過與其受體結(jié)合，激活下游的MAPK和PI3K-Akt等信號通路，直接促進(jìn)膽管上皮細(xì)胞的持續(xù)分裂與擴(kuò)增。這種廣泛的促增殖作用為類器官的初始形成和后續(xù)傳代擴(kuò)增提供了必要的生長動力。

成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）

成纖維細(xì)胞生長因子家族成員（特別是FGF10）是驅(qū)動膽管類器官形態(tài)構(gòu)建的關(guān)鍵因子。FGF信號在膽管系統(tǒng)的胚胎發(fā)育中起著核心作用，在體外培養(yǎng)中同樣指導(dǎo)著類器官的管腔形成和出芽生長。它通過調(diào)控細(xì)胞的極性建立和定向遷移，促進(jìn)復(fù)雜的三維管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的生成，這對于構(gòu)建功能性的膽管模型至關(guān)重要。

第二部分：核心信號通路的精密調(diào)控

除了直接的生長因子，幾條核心信號通路的精確平衡對膽管類器官的特異性分化與功能維持起著決定性作用。

Wnt/β-catenin信號通路

Wnt信號通路是啟動膽管類器官形成的首要開關(guān)。適度的Wnt信號激活（通常由Wnt3a配體介導(dǎo)）能夠誘導(dǎo)膽管上皮細(xì)胞的去分化和增殖，促進(jìn)類器官的初始形成。然而，該通路的活性需要被嚴(yán)格控制在特定水平，過度或持續(xù)的Wnt信號激活反而會抑制膽管特異性標(biāo)志物的表達(dá)，干擾其正常的功能成熟。

TGF-β/BMP信號通路

轉(zhuǎn)化生長因子-β和骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號通路在膽管類器官中構(gòu)成一個精密的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。與小腸類器官需要強(qiáng)力抑制BMP不同，膽管類器官的培養(yǎng)需要適度保留特定的TGF-β/BMP信號活性。這些通路在誘導(dǎo)膽管特異性基因表達(dá)和建立細(xì)胞極性中發(fā)揮關(guān)鍵作用。然而，其濃度平衡至關(guān)重要，過強(qiáng)的信號會誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致類器官結(jié)構(gòu)破壞和功能喪失。

第三部分：小鼠膽管類器官模型構(gòu)建

小鼠膽管類器官培養(yǎng)基（擴(kuò)增）的制備：將基礎(chǔ)培養(yǎng)基、細(xì)胞因子及各類添加物按既定比例混合，配制成培養(yǎng)基。

1、原代

（1）在超凈臺里快速剖開小鼠腹腔，取出肝組織，置于預(yù)冷PBS（加青霉素、鏈霉素、原代抗生素）中清洗。

（2）將清洗后的組織塊收集到1.5ml EP管中，使用無菌尖頭眼科手術(shù)剪將組織塊盡量剪碎(勻漿狀）。組織剪切程度與消化時間相關(guān)，剪切程度越高則消化時間越短，將剪碎后的組織轉(zhuǎn)移至15ml無菌離心管中。

（3）加10倍體積的組織消化液消化，37℃震蕩10-30min，消化過程中隨時觀察情況。當(dāng)視野中觀察到有大量細(xì)胞漏出，且大部分細(xì)胞呈細(xì)胞團(tuán)塊時，可終止消化（注：不要消化到單細(xì)胞狀態(tài)）。

（4）在確認(rèn)消化完成的組織懸液中，加入胎牛血清（FBS）至終濃度達(dá)2-5%或終濃度為0.1%的BSA后吹打混勻。

（5）將組織與細(xì)胞懸液過70µm細(xì)胞濾網(wǎng)，將過濾后的細(xì)胞懸液1000rpm，離心5min，離心后去上清。

（6）若離心后沉淀中觀察到明顯的紅色沉淀（紅細(xì)胞），加入2ml紅細(xì)胞裂解液，吹打混勻后放置3min。加10ml PBS重懸終止裂紅， 1000rpm 離心5min后，棄上清。

（7）適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基或PBS重懸沉淀。

（8）以合適的比例混合基質(zhì)膠和細(xì)胞，24孔細(xì)胞培養(yǎng)板為例，每孔點(diǎn)膠25-30ul基質(zhì)膠混合物進(jìn)行鋪板（4℃下操作）。

（9）將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中20-30min成膠，添加適量小鼠膽管類器官培養(yǎng)基（擴(kuò)增）進(jìn)行培養(yǎng)。

2、類器官傳代培養(yǎng)

（1）移液槍吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2ml 4℃ PBS，放置2min。

（2）移液槍輕柔吹打基質(zhì)膠，收集在15ml離心管中，PBS定容到10-14ml ，4℃靜置20-30min，每3-5孔為一組。1000rpm離心5min棄去液體，保留沉淀。

（3）添加適量基質(zhì)膠重懸類器官，每孔25-30ul基質(zhì)膠鋪在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置培養(yǎng)箱中20-30min成膠，添加適量小鼠膽管類器官培養(yǎng)基（擴(kuò)增）培養(yǎng)。

3、類器官凍存

（1）移液槍吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2ml 4℃ PBS，放置2min。

（2）移液槍輕柔吹打基質(zhì)膠，收集在15ml離心管中，PBS定容到10-14ml ，4℃靜置20-30min，每3-5孔為一組。1000rpm離心5min棄去液體，保留沉淀。

（3）添加適量類器官凍存液，輕柔吹打重懸，以24孔細(xì)胞培養(yǎng)板為例，密度為2-3個孔凍存1管，每管體積1ml。

（4）做好標(biāo)記信息，進(jìn)行程序降溫后，移入液氮長期保存。

4、類器官復(fù)蘇

（1）取10ml DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基于15ml離心管中。

（2）從液氮罐中取出凍存的類器官，快速置于 37℃水浴鍋中融解。

（3）水浴融解過程中，需輕輕搖動冷凍管，以確保凍存液在 1-2min內(nèi)融解。

（4）將溶解后的類器官快速轉(zhuǎn)移至15ml 離心管，使用移液器輕輕吹打6-8次，1000rpm離心 5min，然后除去上清液并收集類器官沉淀。

（5）基質(zhì)膠重懸，每孔25-30ul基質(zhì)膠鋪在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置培養(yǎng)箱中20-30min成膠，添加適量小鼠膽管類器官培養(yǎng)基（擴(kuò)增）。

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